分光光度(du)計在(zai)核(he)酸的定(ding)量(liang)上(shang)也(ye)起(qi)著(zhe)重要作(zuo)用

　　分(fen)光光度(du)計在(zai)核(he)酸的定(ding)量(liang)上(shang)也(ye)起(qi)著(zhe)重要作(zuo)用

　　分光光度(du)計是(shi)指，使(shi)單色儀或(huo)特殊(shu)光源供給的特定波(bo)長的(de)單色光通過標準試(shi)樣(yang)和(he)被(bei)分(fen)析(xi)試(shi)樣(yang)，比較(jiao)兩(liang)者(zhe)的(de)光強(qiang)度(du)分析(xi)物質成(cheng)分的分光器。已經成(cheng)為(wei)現代分子生物實(shi)驗室的(de)常(chang)規儀器。

　　核(he)酸的定(ding)量(liang)是(shi)分光光度(du)計使(shi)用(yong)頻(pin)率比較(jiao)高的(de)功(gong)能。可以(yi)對可(ke)溶(rong)於(yu)緩沖(chong)液(ye)中(zhong)的寡(gua)核苷酸、單鏈(lian)、雙(shuang)鏈(lian)DNA和RNA進(jin)行(xing)定(ding)量(liang)。核酸最高(gao)吸(xi)收峰的(de)吸收波(bo)長為(wei)260nm。由(you)於每(mei)個(ge)核酸的分(fen)子(zi)結構不(bu)同，因此其換(huan)算系(xi)數不(bu)同。要對不(bu)同類型的核酸進(jin)行(xing)定(ding)量(liang)，需(xu)要預(yu)先(xian)選(xuan)擇對應的(de)系(xi)數。測(ce)試(shi)後(hou)的吸(xi)光值經(jing)過上(shang)述(shu)系(xi)數的(de)換(huan)算，得(de)到(dao)了相應的(de)樣(yang)品(pin)濃度(du)。測試(shi)前，選(xuan)擇正確(que)的步驟，輸入(ru)原(yuan)液和(he)稀(xi)釋(shi)液(ye)的(de)體(ti)積，然(ran)後(hou)測試(shi)空白液(ye)和(he)樣(yang)品(pin)液。但是(shi)，實(shi)驗並(bing)不(bu)順利(li)。讀(du)數(shu)不(bu)穩(wen)定可(ke)能(neng)是(shi)實(shi)驗者(zhe)最頭痛的(de)問(wen)題。靈(ling)敏(min)度(du)越高的機器，吸(xi)光值的(de)漂(piao)移(yi)越大。

　　事實(shi)上(shang)，分(fen)光光度(du)計的(de)設(she)計原(yuan)理和(he)工(gong)作(zuo)原(yuan)理允許吸(xi)光值在(zai)壹(yi)定範(fan)圍內變(bian)化(hua)。也(ye)就(jiu)是(shi)說(shuo)，儀器有(you)壹定的精(jing)度(du)和精(jing)度(du)。另(ling)外，還(hai)需(xu)要考慮(lv)核酸本身(shen)的(de)化(hua)學(xue)性質和溶(rong)解核(he)酸的緩沖(chong)液(ye)的(de)pH、離子濃(nong)度(du)等(deng)。測(ce)試(shi)時離子濃(nong)度(du)過高(gao)時，讀(du)取(qu)值有(you)時會漂(piao)移(yi)，因此(ci)推(tui)薦使用(yong)像TE這(zhe)樣(yang)pH值恒(heng)定(ding)、離子濃(nong)度(du)低的緩沖(chong)液(ye)。

　　樣(yang)品(pin)的稀(xi)釋(shi)濃(nong)度(du)也(ye)是(shi)不(bu)可(ke)忽(hu)視的(de)因素(su)：因為(wei)樣(yang)品(pin)中(zhong)不(bu)可(ke)避免地存(cun)在細小(xiao)的(de)粒(li)子(zi)，特別是(shi)核酸樣(yang)品(pin)。這(zhe)些小(xiao)粒(li)子(zi)的(de)存在會幹擾(rao)測試(shi)效果。為(wei)了將(jiang)粒子對檢查(zha)結(jie)果的影(ying)響(xiang)控制在(zai)最小(xiao)限度(du)，核酸的吸(xi)光值優(you)選(xuan)至(zhi)少大(da)於(yu)0.1A，吸(xi)光值優(you)選(xuan)為(wei)0.1-1.5A。在(zai)這(zhe)個範圍(wei)內，粒子(zi)的幹(gan)擾(rao)比較(jiao)小(xiao)，結(jie)果穩(wen)定。因(yin)此(ci)，這(zhe)意味著(zhe)樣(yang)品(pin)的濃度(du)不(bu)能(neng)過低或(huo)過高(gao)(超(chao)出(chu)光度(du)計的(de)測(ce)試(shi)範圍)。

　　最後(hou)是(shi)操作(zuo)要素。如果混(hun)合(he)不(bu)充分，吸光值太(tai)低，會出(chu)現負(fu)值。混(hun)合(he)液(ye)中(zhong)不(bu)能(neng)存(cun)在氣泡。空白液(ye)中(zhong)沒有(you)懸浮(fu)物(wu)。否(fou)則(ze)，讀(du)數(shu)漂(piao)移(yi)會很(hen)劇(ju)烈(lie)；必須(xu)使(shi)用(yong)相同的比色杯(bei)測試(shi)空白液(ye)和(he)樣(yang)品(pin)。不(bu)這(zhe)樣(yang)做(zuo)的(de)話(hua)，濃(nong)度(du)差(cha)異太(tai)大(da)了；換(huan)算系(xi)數和(he)樣(yang)品(pin)濃度(du)單位的(de)選(xuan)擇壹(yi)致(zhi)；窗(chuang)戶磨(mo)損的彩(cai)杯(bei)不(bu)能(neng)采(cai)用；樣(yang)品(pin)的體積必須(xu)達(da)到(dao)彩(cai)杯(bei)所(suo)要求的最小(xiao)體(ti)積等(deng)，有(you)很(hen)多操作(zuo)事項。

　　除(chu)了核酸濃度(du)，分光光度(du)計還(hai)同時給出(chu)了壹些(xie)非(fei)常(chang)重要的比值，代表(biao)了樣(yang)品(pin)的純度(du)。例(li)如，A260/A280之(zhi)比因(yin)為(wei)蛋(dan)白的(de)吸(xi)收峰為(wei)280nm，所(suo)以(yi)用(yong)於評價(jia)樣(yang)品(pin)的純度(du)。純樣(yang)本比大(da)於1.8(DNA)或(huo)2.0)RNA)。比值小(xiao)於(yu)1.8或(huo)2.0時，表(biao)示(shi)有(you)蛋(dan)白質或(huo)酚類(lei)的影(ying)響(xiang)。A230表(biao)示(shi)樣(yang)品(pin)中(zhong)存在(zai)碳水化合(he)物、多肽(tai)、苯酚(fen)等(deng)汙(wu)染物，比較(jiao)純凈(jing)的核酸A260/A230之(zhi)比大(da)於2.0。檢測(ce)A320溶(rong)液的濁度(du)和其(qi)他幹擾(rao)因素(su)。純(chun)樣(yang)品(pin)，A320壹般為(wei)0。